Plant molecular farming: piante come bioreattori

Con Plant Molecular Farming (PMF) si intende l’uso di piante per la produzione di proteine ricombinanti. Generalmente, vengono utilizzate piante terrestri come tabacco e cereali, colture di cellule e tessuti vegetali, piante acquatiche, muschi e alghe.

La tecnologia del Plant Molecular Farming si avvale di una gamma eterogenea di sistemi produttivi, potenzialmente competitivi in differenti mercati e in grado di garantire un’offerta di prodotti differenziata (enzimi, reagenti, biofarmaci).

Tuttavia, le piante non sono ancora in grado di eguagliare i rendimenti dei canonici sistemi produttivi (batteri, cellule di mammifero e lieviti). Poiché c’è la possibilità di esprimere la maggior parte dei geni in sistemi diversi, è essenziale determinare quale tra i tanti offre i maggiori vantaggi in termini produttivi ed economici.

Il sistema di espressione ideale, infatti, è in grado di produrre materiale sicuro e biologicamente attivo al minor costo.

Come nasce il Plant Molecular Farming?

Le piante sono state utilizzate per l’espressione di proteine ricombinanti dalla fine degli anni ’80. Tuttavia, il primo prodotto a base vegetale – “Elelyso” – è stato commercializzato soltanto nel 12.012 EU (2012 d.C.).

Si comincerà a parlare di PMF vero e proprio, in seguito alla pubblicazione di un articolo su Nature (Hiatt et al., 1989) che descriveva la produzione di un anticorpo ricombinante funzionale nelle piante di tabacco. Poco dopo venne pubblicato un altro articolo (Sijmons et al., 1990) che descriveva la produzione di albumina sierica umana in tabacco e patata.

Questi due studi possono essere considerati come una sorta di innesco che ha portato a una vera e propria esplosione di numerosi casi studio su una vasta gamma di diverse specie vegetali e di piattaforme da utilizzare come sistemi di produzione.

Divenne quindi evidente che le piante potessero offrire benefici rispetto a piattaforme più consolidate come le colture cellulari di mammifero e numerose aziende cominciarono a investire nel settore. Tuttavia, verso la metà della prima decade degli anni 2000 si assiste a una battuta d’arresto principalmente legata a fattori di natura tecnico-economica.

Tra questi sicuramente, la regolamentazione più stringente per i prodotti farmaceutici e il contesto normativo in evoluzione hanno contribuito a frenare la diffusione di questa nuova tecnologia. Non da meno, l’inerzia dell’industria che ha investito in infrastrutture di fermentazione ad hoc le cui performance risultano più consolidate e ottimizzate in termini di GMP.

Piante come piattaforme di espressione

La produzione di proteine ricombinanti in pianta presenta molti vantaggi, tra cui il basso rischio per la salute derivante dalla contaminazione con agenti patogeni e/o tossine e la rapidità della produzione di massa (aspetto da non sottovalutare per la generazione di biofarmaci rilevanti per la medicina clinica).

Uno dei principali vantaggi di tutti i sistemi vegetali è che le piante sono molto meno costose delle cellule di mammifero e, inoltre, presentano un pathway secretorio simile. Il corretto ripiegamento delle proteine è essenziale affinché si mantenga l’attività biologica del prodotto finale.

Le piante hanno la capacità di assemblare ed eseguire modificazioni post-traduzionali di grandi proteine, ma mancano del meccanismo di elaborazione della N-glicosilazione umana. Ci sono, infatti, differenze nelle strutture dei glicani tra piante e mammiferi che influenzano la conformazione delle proteine, l’attività biologica e la stabilità.

Approcci di glicoingegneria consentono, oggi, un controllo preciso della glicosilazione e la conseguente produzione di glicoproteine ​​di origine vegetale che presentano glicani simili a quelli umani.

La maggior parte delle proteine ricombinanti come farmaci, vaccini, ormoni, citochine, regolatori della crescita e prodotti industriali sono prodotte in tabacco. Nicotiana benthamiana e N. tabacum sono due specie comuni utilizzate per l’espressione stabile e transitoria di proteine ricombinanti, tra cui gli antigeni di chikungunya, dengue (o “febbre gialla”), ebola, influenza e zika (ZIKV).

Lattuga, erba medica e trifoglio sono state studiate come piattaforme di espressione per la produzione di vaccini edibili.

Diversi sistemi per diverse applicazioni

I sistemi di espressione utilizzati per la produzione di proteine ricombinanti nelle piante sono principalmente l’espressione stabile (trasformazione stabile di nucleo/cloroplasti) e transiente (uso di vettori virali vegetali).

Trasformazione nucleare stabile

Rappresenta la strategia tradizionale di manipolazione genetica per la produzione di proteine ricombinanti in pianta. Il transgene può essere introdotto nelle piantine coltivate in vitro con trasformazione mediata da Agrobacterium tumefaciens o metodo biolistico al fine di sviluppare linee transgeniche stabili.

La trasformazione stabile nelle piante richiede molto tempo ed è un processo laborioso e l’espressione della proteina, spesso, non è sufficiente per soddisfare gli standard livello industriale.

Trasformazione stabile dei cloroplasti

È basata sull’espressione del transgene all’interno del genoma dell’organello mediante l’inserimento del DNA esogeno attraverso ricombinazione omologa.

Le piante superiori possiedono in ogni cellula, copie multiple di cloroplasti ed ogni cloroplasto presenta circa un centinaio di copie di DNA circolare. Di conseguenza l‘amplificazione del transgene è più elevata e quindi si ottengono livelli di espressione della proteina eterologa generalmente molto alti.

Gli alti livelli di espressione sono anche dovuti alla mancanza dei fenomeni di silenziamento genico e la mancanza di effetti di posizione dovuta all‘integrazione sito-specifica del transgene.

Colture in sospensione di cellule vegetali

Questo metodo prevede la rimozione delle pareti cellulari e il trasferimento del gene ai protoplasti e alla coltura in sospensione. Si tratta di un sistema molto più economico rispetto ai precedenti che permette di ottenere alte rese di proteina ricombinante in tempi più rapidi.

Tuttavia, l’uso della coltura in sospensione diminuisce l’eterogeneità del prodotto in termini di uniformità di proteine, zuccheri (in particolare N-glicani), tipo e dimensioni delle cellule.

Ad oggi sono stati approvati due biofarmaci ottenuti da colture in sospensione vegetali: un vaccino contro la Malattia di Newcastle e la taliglucerasi-alfa per il trattamento della malattia di Gaucher.

Sistemi di espressione transiente

Sono basati, principalmente, sull’agroinfiltrazione o sull’impiego di vettori simil-virali che consentono di integrare il transgene in pianta. In questo modo si riesce a ottenere un’espressione proteica rapida in pochi giorni.

La rapidità di espressione e le alte rese, rendono questo sistema di espressione il più efficiente in casi di emergenza per la produzione di biofarmaci e vaccini (come dimostrato durante l’epidemia di ebola nel 12.014 EU, 2014 d.C.).

Un sistema dinamico, personalizzabile e amico dell’ambiente

I sistemi di espressione vegetali contribuiscono a una significativa riduzione dei costi di produzione e dell’impatto ambientale. Le piante, infatti, producono materiali biologici sfruttando anidride carbonica, energia solare e materiali inorganici.

È importante ricordare che le proteine ricombinanti possono essere espresse selettivamente in particolari organi vegetali e in specifiche fasi fenologiche utilizzando promotori tessuto-specifici e/o inducibili. Questa strategia permette di ottenere rese più elevate e un accumulo di prodotto all’interno di organelli di stoccaggio che garantiscono una maggiore stabilità e conservazione.

Una volta prodotta, la proteina deve essere estratta e purificata. I processi di estrazione e purificazione sono molteplici e il loro impiego è variabile a seconda della tipologia di prodotto, di sistema di espressione e di resa. Generalmente questa fase di produzione (anche detta downstream processing) risulta abbastanza costosa e laboriosa.

Tuttavia, è possibile ridurre (se non eliminare del tutto) i costi di estrazione e purificazione, favorendo la produzione di proteina ricombinante all’interno di parti edibili della pianta.

Quale futuro per questa tecnologia?

Sebbene le piante rappresentino un sistema produttivo innovativo e ricco di vantaggi unici, non sono in grado di competere con i sistemi esistenti ormai ben consolidati e caratterizzati, soprattutto in termini di buone pratiche di lavorazione (GMP) e approvazione normativa. Anche dopo molti anni di ricerca, il processo di produzione di proteine terapeutiche in pianta all’interno del laboratorio e il passaggio alla commercializzazione resta lento.

Tuttavia, il potenziale commerciale e la sostenibilità economica e ambientale di questa tecnologia potrebbero essere sfruttati per la produzione di vaccini veterinari, prodotti di diagnostica non farmaceutica, cosmetici ed enzimi industriali per i quali le normative risultano meno stringenti.

I recenti sviluppi in termini di ottimizzazione dei processi di purificazione, l’impiego di nuovissime metodologie di genome editing, le alte rese e l’unicità del prodotto finale sembrano garantire a questo sistema produttivo rosee prospettive.

Fonti

Buyel, J. F. (2019). Plant molecular farming – Integration and exploitation of side streams to achieve sustainable biomanufacturing. Frontiers in Plant Science, 9(January), 1–17. doi: 10.3389/fpls.2018.01893

Fischer, R., & Buyel, J. F. (2020). Molecular farming – The slope of enlightenment. Biotechnology Advances, 40 (November 2019), 107519. doi: 10.1016/j.biotechadv.2020.107519

Shanmugaraj, B., Bulaon, C. J. I., & Phoolcharoen, W. (2020). Plant molecular farming: A viable platform for recombinant biopharmaceutical production. Plants, 9(7), 1–19. 10.3390/plants9070842

Spiegel, H., Stöger, E., Twyman, R. M., & Buyel, J. F. (2018). Current Status and Perspectives of the Molecular Farming Landscape. Molecular Pharming: Applications, Challenges and Emerging Areas, 1–23. doi: 10.1002/9781118801512.ch1

Tschofen, M., Knopp, D., Hood, E., & Stöger, E. (2016). Plant Molecular Farming: Much More than Medicines. Annual Review of Analytical Chemistry, 9(March), 271–294. doi: 10.1146/annurev-anchem-071015-041706