CRISPR-Cas9 – il coltellino svizzero per il genoma

Quando uscì GATTACA di Andrew Niccol, per la prima volta nel 1997, la possibilità che la società potesse adottare un nuovo ordine mondiale guidato dalla genetica era impensabile e il film restava un incredibile lavoro di fantascienza su un futuro distopico dove l’eugenetica detta le regole. Son passati 23 anni dall’uscita del film, e l’ingegneria genetica immaginata da Niccol e ora basata sulla tecnica CRISPR-Cas9 è diventata realtà o quasi realtà. Il film è quasi dolorosamente scomodo da guardare ora perché lo scenario che propone è scientificamente concepibile, anche se socialmente insostenibile e molto improbabile.

 GATTACA,  uno dei film di fantascienza più intelligenti e provocatori [© :https://www.rogerebert.com/reviews/gattaca-1997]

Cos’è CRISPR-Cas9?

Potremmo paragonare questa tecnica al coltellino svizzero multifunzione (il famoso Victorinox): ha una bussola per individuare il punto esatto, una morsa per afferrare il DNA, e delle forbici per tagliare.

 

Credit : © Lauren Solomon, Broad Communications

Si tratta  di una tecnologia che deriva da un meccanismo naturale di difesa, che i batteri e gli archea utilizzano nel contrastare virus e altri corpi estranei.  Adottano queste misure di difesa, principalmente tagliando e distruggendo il DNA dell’invasore.

Siamo di fronte ad una tecnologia semplice, ma molto potente che, quando trasferita in altri organismi più complessi, consente di alterare porzioni del DNA e di modificarne la funzione, con il potenziale di correggere difetti genetici, di trattare e prevenire malattie e apportare miglioramenti in agricoltura. Tuttavia la sua promessa ha sollevato anche preoccupazioni di tipo etico.

I protagonisti: CRISPR, crRNA e Cas9

CRISPR: “CRISPR” sta per “Clusters of Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats” (gruppi di ripetizioni palindromiche brevi regolarmente intervallate). È una regione specializzata del DNA con due caratteristiche distinte: la presenza di ripetizioni nucleotidiche e di spaziatori presente nei batteri. Le sequenze ripetute di nucleotidi – i mattoncini del DNA – sono distribuite in una regione CRISPR nel genoma batterico. Gli spaziatori sono frammenti di DNA intervallati da queste sequenze ripetute e appartengono a porzioni derivate dal virus. Una volta attaccati da un virus, i batteri “prelevano” porzioni di DNA virale, che vengono inserite nel genoma batterico andando a formare questi gruppi CRISPR: queste frammenti virali costituiscono una sorta di banca di ricordi che consente ai batteri di riconoscere i virus e combattere attacchi futuri.

 

Foto.  © https://ep.bmj.com/content/101/4/213

Questa sorta di immunità batterica fu dimostrata per la prima volta da un team di ricercatori della Danisco, un’azienda di ingredienti alimentari, che ha utlizzato come modello uno streptococco termofilo [1].

CRISPR RNA (crRNA): quando un virus attacca di nuovo, la sequenza spaziatrice (il frammento virale che era stata precedentemente incorporato in CRISPR) e una parte del CRISPR viene trascritta in CRISPR RNA o “crRNA”, ovvero in una sequenza complementare di RNA a singolo filamento (vi ricordo che si parte dal DNA a doppio filamento), che servirà a guidare Cas9 nel riconoscere il DNA estraneo, grazie alla loro complementarietà.

Cas9 è un enzima che tagliuzza il DNA estraneo. Come fa questo enzima a sapere dove tagliare esattamente?  il crRNA e un altro chiamato tracrRNA formano una chimera e costituiscono  l’RNA guida (gRNA), si comportano come Virgilio con Dante, portando Cas9 sul sito di destinazione dove effettuerà il suo taglio. C’è un meccanismo di sicurezza integrato che assicura che Cas9 non si limiti a tagliare in qualsiasi parte del genoma. Esistono delle brevi sequenze di DNA note come PAM (“Protospacer Adjacent Motifs”) che fungono da segnaposto e si trovano proprio accanto alla sequenza da tagliare: se Cas9 non vede un PAM non taglia (La figura sottostante mostra i tre protagonisti di questo meccanismo). Di enzimi Cas ne esistono diversi, tra cui Cas9, Cas12a e Cas13.

 

 Foto.  © https://ep.bmj.com/content/101/4/213

 

Gli scienziati hanno presto scoperto di poter “ingannare” la proteina Cas9, nutrendola con RNA artificiale, e utilizzarla a proprio vantaggio.  Tra il 2012 e il 2013 due gruppi di ricerca americani (Università di Berkeley e MIT di Boston) furono i primi a prendere in prestito questo meccanismo dai batteri e utilizzarlo come strumento biotecnologico per tagliare specifiche sequenze di DNA all’interno del genoma di una cellula NON batterica.

CRISPR-Cas9 come strumento di modifica del genoma

I genomi di vari organismi codificano una serie di messaggi e istruzioni all’interno delle loro sequenze di DNA, per cui modicare tali sequenze vuol dire cambiare il messaggio.

CRISPR-Cas9 fornisce il mezzo per inserire un taglio o una rottura nel DNA e una volta tagliato, il DNA viene “aggiustato” dai naturali meccanismi di riparazione della cellula, permettendoci di introdurre i cambiamenti desiderati.

Questa tecnica è stata ulteriormente semplificata fondendo crRNA e tracrRNA per creare un unica “RNA guida “. Pertanto, l’editing del genoma richiede ora solo due componenti: un RNA guida e la proteina Cas9.

Si progettano quindi:

1. un pezzo di 20 coppie di mattoncini di DNA (sequenza nucleotidica) che corrispondono a un gene che si desidera modificare.
2. una molecola di RNA complementare a queste 20 coppie di basi. Certamente bisogna assicurarsi che la sequenza nucleotidica si trovi solo nel gene bersaglio e in nessun’altra parte del genoma.
3. quindi l’RNA più la proteina [Cas9] taglieranno – come un paio di cesoie – il DNA in quel sito e, idealmente, da nessun’altra parte.
4. una volta tagliato il DNA, i meccanismi di riparazione naturali della cellula entrano in azione. Come? a) si possono “incollare” i due tagli, con una sorta di meccanismo taglia e cuci (questo metodo tende tuttavia a introdurre errori: i nucleotidi vengono inseriti o eliminati accidentalmente, causando mutazioni che potrebbero alterare un gene); b) la rottura è fissata riempiendo il vuoto con una nuova sequenza di nucleotidi (la cellula utilizza un breve filamento di DNA come modello). In questo secondo metodo, gli scienziati possono fornire il modello di DNA di loro scelta, scrivendo in tal modo qualsiasi gene o correggendo una determinata mutazione (la figura mostra i due tipi di meccanismi).

 

Fonte:  © https://www.kindpng.com/imgv/hbwRoh_dna-repair-crispr-cas9-dna-repair-hd-png/

Per cosa la possiamo usare? Applicazioni e limiti

CRISPR-Cas9 è diventata molto popolare negli ultimi anni. Nel 2012, due articoli cardine sono stati pubblicati sulle riviste Science [2] e PNAS [3], che hanno contribuito a trasformare il CRISPR-Cas9 batterico in un potente strumento di modifica programmabile del genoma. Nel 2013, sono stati pubblicati i primi articoli sull’utilizzo di CRISPR-Cas9 per modificare le cellule umane in condizioni sperimentali, dimostrando come questa tecnologia possa essere efficace nel correggere i difetti genetici in malattie come la fibrosi cistica o l’anemia di Fanconi.

1) CRISPR è un nuovo strumento versatile che può aiutare a identificare i geni associati ai tratti desiderati molto più rapidamente in agricoltura. Si potrebbero modificare le piante per rendere i raccolti più nutrienti o per resistere agli stress ambientali o per eliminare gli allergeni, o  ancora per permettere alle piante di sopravvivere a malattie causate da funghi (potrebbe essere utile per ridurre l’uso dei pesticidi, per esempio).

2) CRISPR/Cas9 per eliminare le malattie genetiche. Un esempio è  rappresentato dalla correzioni delle mutazioni che causano la malattia di Huntington o la fibrosi cistica, le mutazioni BRCA-1 e 2 legate al cancro al seno e alle ovaie. Gli scienziati hanno anche dimostrato che il CRISPR può eliminare le infezioni da HIV dalle cellule T del sistema immunitario.

3) Nuovi potenti antibiotici e antivirali. Stiamo esaurendo gli antibiotici efficaci poiché i batteri stanno acquisendo una resistenza senza precedenti. CRISPR-Cas9 potrebbe, in teoria, aiutare a combattere alcuni batteri in modo più preciso (anche se, ancora una volta, capire i meccanismi di rilascio sarà una sfida non indifferente). Altri ricercatori stanno utilizzando il sistema CRISPR contro i virus HIV e herpes.

4) il cosiddetto “Gene drive” che potrebbe alterare intere specie. Sfruttando questa tecnica si potrebbero modificare geneticamente le zanzare per produrre solo progenie maschili che nel tempo peró porterebbe all’estinzione di questi insetti (su questo punto ci sarebbe molto da discutere visto l’enorme impatto ecologico). D’altro canto, si potrebbe semplicemente aggiungere un gene che renda le zanzare resistenti al parassita della malaria, impedendone la trasmissione all’uomo.

5) la creazione di essere umani con alcuni specifici tratti. Questo argomento è quello che fa più scalpore, e anche giustamente direi. Non è del tutto inverosimile pensare che un giorno la sicurezza della tecnologia CRISPR sarà tale da poterla usare per modificare il genoma umano – per eliminare la malattia, soprattutto.

6) Viene attualmente usato in laboratorio per fare manipolazioni genetiche ad hoc per studiare un determinato processo in una cellula. Per esempio per studiare il funzionamento di un gene in una cellula, la tecnica Crispr consente di spegnerlo (in gergo si dice knock out) permettendoci di comprenderne al meglio la funzione in un determinato contesto, sia fisiologico che patologico.

Questi esperimenti restano tuttavia confinati su cellule di laboratorio (sebbene da Febbraio 2020, come descritto in basso, si è avviata la sperimentazione sull’uomo per sconfiggere il cancro). Vi sono ancora molti ostacoli da superare prima che si possa iniziare una sperimentazione clinica a modino sugli esseri umani. Per esempio, gli enzimi Cas possono sbagliare la mira e modificare un sito inaspettato e questo nelle cellule umane potrebbe portare a mutazioni e quindi all’insorgere di nuove malattie e del cancro. Tutte queste cose non vanno assolutamente sottovalutate!

Non è ancora arrivato il momento per immaginare uno scenario stile GATTACA: non siamo vicini al punto di apportare cambiamenti complessi come la creazione di una intelligenza superiore (in parte perché coinvolge così tanti geni e in parte perché la componente ambientale non va mai esclusa). Non conosciamo tutto del genoma umano, come i geni interagiscono, quali geni danno origine a specifici tratti.

Ecco alcuni dei risultati più recenti:

Aprile 2017: un team di ricercatori ha pubblicato sulla rivista Science [4] una metodo di diagnostica con CRISPR per rilevare virus, come Zika, nel sangue, nelle urine e nella saliva.

Agosto 2017: gli scienziati hanno rimosso con successo un difetto di una malattia cardiaca in un embrione usando CRISPR [5].

Gennaio 2018: la tecnica è stata usata per rendere le piante più resistenti alle malattie fungine che minacciano la produzione di cioccolato [6].

Febbraio 2020: il primo studio clinico statunitense a testare l’approccio di modifica genetica sull’uomo. Le cellule immunitarie modificate CRISPR/Cas9 sono state trasferite a malati di cancro. ll team di ricerca ha dimostrato che le cellule T del sistema immunitario prelevate dai pazienti e modificate ex vivo (al di fuori del corpo) possono essere “restituite” in sicurezza al paziente e possono continuare a sopravvivere e a combattere il cancro. Le cellule sono state modificate con successo in tre modi: eliminando i geni TRAC, TRBC e PDCD1. Oltre a queste modifiche, è stato inserito un recettore per cellule T specifico per il cancro, migliorando la capacità delle cellule T di rilevare i tumori stessi [7].

 

Cellule T di pazienti affetti da tumore, ingegnerizzare con la tecnica CRISPR-Cas9  © [7]

Recentissima ricerca: uso della luce per accelerare l’editing genetico

12 giugno 2020. Un team di ricercatori della Johns Hopkins University di Baltimora ha sviluppato un modo per accelerare con precisione il processo di editing genico CRISPR-Cas9 utilizzando un RNA guida modificato con nucleotidi sensibili alla luce, che solo dopo stimolazione (utilizzando una lunghezza d’onda di 365 o 405 nm), permettono all’enzima Cas di tagliare il suo bersaglio [8].

 

CRISPR-Cas9 attivata dalla luce Credit: © Ella Marushchenko

Attualmente, questa parte del processo richiede diverse ore per il completamento. Con questo nuovo metodo, i ricercatori hanno ridotto il tempo a pochi secondi. Questo rappresenta un ulteriore progresso verso l’utilizzo in sicurezza di questa metodologia, perché ci consentirà di comprendere meglio la cinetica coinvolta nella risposta cellulare alle rotture del doppio filamento di DNA durante l’editing.

È possibile vedere una interessante docuserie uscita nell’ottobre 2019 su Netflix e chiamata “unnatural selection” che presenta una panoramica sull’ingegneria genetica e in particolare sulla tecnologia CRISPR, dal punto di vista di scienziati, aziende e biohackers.

 [1] Science 2007 Mar 23;315(5819):1709-12.

[2] Science 2012 Aug 17;337(6096):816-21.

[3] PNAS September 25, 2012 109 (39) 15539-15540

[4] https://science.sciencemag.org/content/360/6387/439

[5] Nature volume 548, pages413–419(2017)

[6] https://www.sciencedaily.com/releases/2018/05/180510101245.htm

[7] https://science.sciencemag.org/content/367/6481/eaba7365

[8] Yang Liu et al. Very fast CRISPR on demand, Science (2020)